Aprenda a ler o código genético usando o sequenciamento de DNA e onde o sequenciamento de DNA encontra aplicação .
O sequenciamento de DNA é a determinação da sequência de nucleotídeos em uma molécula de DNA . O sequenciamento de DNA revolucionou as ciências biológicas e inaugurou a era da genômica. Desde 1995, o genoma de mais de 1000 (a partir de 2010) organismos diferentes foi analisado por sequenciamento de DNA .
Juntamente com outros métodos analíticos de DNA, o sequenciamento de DNA também é usado, entre outras coisas, para investigar doenças genéticas . Além disso, o sequenciamento de DNA é um método analítico fundamental, particularmente no contexto da clonagem de DNA ( clonagem molecular ).operações de laboratório de biologia molecular ou engenharia genética , hoje é impossível imaginar a vida sem eles.
Sequenciamento de DNA explicado simplesmente
No DNA (ácido desoxirribonucleico), as bases (adenina, timina, guanina e citosina) estão dispostas em uma fita. Usando o sequenciamento de DNA
, você pode determinar a ordem exata das bases em uma molécula de DNA. A sequência de base contém nossa informação genética de forma criptografada.
Com a ajuda desta informação, nossas células são capazes de produzir proteínas/enzimas ( biossíntese de proteínas ). As proteínas então influenciam a aparência externa ( fenótipo ) ou nosso metabolismo celular.
Atualmente existem inúmeros métodos de sequenciamento como o sequenciamento clássico de Sanger ou o sequenciamento moderno de nanoporos .
O sequenciamento de DNA é um importante método de análise em pesquisa e ciência e é usado, por exemplo, em engenharia genética para identificar doenças hereditárias.
Definição
O sequenciamento de DNA é a determinação da sequência exata dos nucleotídeos (blocos de construção do DNA) no DNA e, assim, ajuda a decodificar a informação genética.
Princípio de sequenciamento de DNA
Já em 2003, o genoma humano (= a totalidade do material genético) foi completamente decodificado usando sequenciamento pela primeira vez. Isso aconteceu como parte do chamado Projeto Genoma Humano.
No entanto, existia/existe um desafio para os pesquisadores sequenciarem longas moléculas de DNA, o que afeta principalmente os genomas de organismos eucarióticos .
Mas há uma solução: os filamentos de DNA de cromossomos grandes são divididos em vários fragmentos, analisados e colocados na ordem correta. Você também se refere ao processo como sequenciamento de espingarda .
Mas observe: Após cada sequenciamento, sempre deve ocorrer a chamada análise de sequência de DNA , pois senão conhecemos apenas a sequência das bases, mas ainda não sabemos exatamente para que servem os cortes. Só então o chamado código genético é totalmente descriptografado.
Métodos clássicos para sequenciamento de DNA
Comecemos pelos métodos clássicos de sequenciamento, ambos desenvolvidos de forma independente e quase simultânea (1975 e 1977): o método de Maxam e Gilbert e o sequenciamento de Sanger .
Método de Maxam e Gilbert
O princípio básico do método de Maxam-Gilbert é fazer com que uma clivagem química do DNA seja examinada. Dependendo da base de DNA, a clivagem é induzida usando reagentes específicos.
Funciona assim: Em 4 lotes de reação diferentes, bases específicas são quimicamente modificadas e removidas da molécula de DNA. Isso leva a uma divisão exatamente nesses lugares. Assim, em cada vaso de reação, obtemos fragmentos de DNA de diferentes comprimentos, cada um com uma base específica no final.
Podemos então separar os fragmentos de DNA longitudinalmente usando a chamada eletroforese em gel . Se compararmos agora as respectivas abordagens, podemos ler a sequência de DNA.
No entanto, o processo é pouco praticado hoje em dia porque, entre outras coisas, são utilizadas substâncias químicas muito perigosas.
Sequenciamento de Sanger
O sequenciamento de Sanger recebeu o nome de seu desenvolvedor, Frederick Sanger . Você também pode chamá-lo de método de terminação de cadeia ou método dideoxy .
O procedimento usa a funcionalidade da reação em cadeia da polimerase (PCR) com a ajuda da enzima DNA polimerase e blocos de construção especiais (didesoxinucleotídeos). O objetivo aqui também é gerar fragmentos de DNA de diferentes comprimentos, que sempre diferem por um par de bases. Os fragmentos são então separados longitudinalmente por eletroforese em gel, também para avaliação.
O processo foi continuamente aprimorado e desenvolvido ao longo dos anos e ainda é usado em pesquisas hoje.
Se você deseja conhecer o processo exato de sequenciamento do Sanger e o propósito dos blocos de parada, nosso vídeo é ideal para você.
Métodos modernos para sequenciamento de DNA
Como o sequenciamento de DNA rapidamente ganhou alta prioridade na pesquisa, métodos mais rápidos e eficientes tiveram que ser desenvolvidos. Os chamados métodos de alto rendimento permitem que genomas inteiros sejam sequenciados em poucos dias. Você também pode se referir aos métodos como sequenciamento de segunda geração ( = métodos de sequenciamento de segunda geração ) .
Gostaríamos de explicar três métodos para você com mais detalhes abaixo: Pirosequenciamento , sequenciamento de semicondutores e sequenciamento de nanoporos .
Pyrosequenzierung
A enzima DNA polimerase é utilizada na pirosequenciação , bem como no método de terminação da cadeia . Nós “observamos” o trabalho da DNA polimerase em tempo real.
A tarefa da DNA polimerase é completar uma fita simples de DNA para formar uma fita dupla de DNA adicionando e ligando nucleotídeos adequados (complementares). No pirosequenciamento, uma base é adicionada uma após a outra. Quando a DNA polimerase incorporou com sucesso a base apropriada, um sinal de luz é liberado em cada caso. O sinal de luz pode ser captado por um detector e convertido em uma sequência de base.
A energia para gerar o sinal de luz vem da separação do pirofosfato (= dois grupos fosfato), que é sempre liberado quando os nucleotídeos apropriados são incorporados corretamente. Enzimas adicionadas – as luciferases – podem usar essa energia para gerar luz. Você também pode descrever a forma de geração de luz como bioluminescência.
O método é usado, por exemplo, quando queremos descobrir quantas mutações genéticas estão presentes no genoma.
sequenciamento de semicondutores
O sequenciamento de semicondutores é semelhante ao princípio do pirosequenciamento. No entanto, não medimos um sinal de luz aqui, mas íons liberados (H + ) . No sequenciamento de semicondutores também estamos lidando com DNA de fita simples que deve ser completado em fita dupla pela DNA polimerase.
Quando um nucleotídeo adequado é incorporado, um próton (= íon carregado positivamente) é liberado. Isso é detectado por um chamado semicondutor e passado para um computador para avaliação. Isso nos permite determinar a sequência de base.
sequenciamento de nanoporos
Na verdade, podemos contar o sequenciamento de nanoporos como parte da “terceira geração”, pois apenas examinamos moléculas de DNA individuais no processo (= sequenciamento de molécula única ). Nenhuma PCR prévia é, portanto, necessária para produzir material de DNA suficiente para sequenciamento.
No processo, uma única fita de DNA passa por um chamado nanoporo. Com isso você pode significar um canal muito pequeno dentro de uma membrana. No nanoporo, uma voltagem elétrica é usada para gerar uma corrente de íons que é medida. Como as respectivas bases de DNA diferem em tamanho, elas também bloqueiam o nanoporo em diferentes extensões. Isso, por sua vez, influencia a corrente de íons, porque dependendo do espaço necessário, mais ou menos íons podem fluir. Um valor específico é então obtido para cada nucleotídeo por meio de medições atuais. É assim que podemos descobrir a sequência de bases da molécula de DNA.
Aplicações de sequenciamento de DNA
Finalmente, vejamos as aplicações do sequenciamento de DNA.
Um campo de aplicação é o diagnóstico médico. Por exemplo, podemos usar o sequenciamento de DNA para identificar doenças hereditárias , como a doença de Huntington, como parte de um teste genético. Isso nos permite avaliar o risco da doença e iniciar uma terapia adequada o mais rápido possível. Infelizmente, os métodos ainda são muito complexos e caros para sequenciar rotineiramente nosso genoma humano.
Além disso, o sequenciamento de DNA é usado em filogenética . Isso significa que os pesquisadores lidam com a origem dos seres vivos e suas relações. Os dados obtidos a partir do sequenciamento são então usados para criar árvores genealógicas.
problema
O sequenciamento de DNA como leitura da sequência de nucleotídeos no DNA foi um problema não resolvido por décadas até meados da década de 1970. Vários métodos bioquímicos ou biotecnológicos estão disponíveis hoje, mais detalhes podem ser encontrados na seção Métodos de Sequenciamento . No entanto, a arte do sequenciamento de DNA não se limita a estes métodos de leitura direta: Devido a limitações técnicas, apenas seções curtas de DNA ( leituras ) de menos de 1000 bp (pares de bases) são lidas em cada reação de sequenciamento individual. Em um projeto de sequenciamento , seções de DNA mais longas devem primeiro ser divididas em unidades menores ( sequenciamento shotgun), sequenciado e depois remontado em uma sequência geral completa. Projetos de genoma, como o projeto genoma humano , no qual vários bilhões de pares de bases são sequenciados, exigem, portanto, uma abordagem organizada e coordenada e o uso de métodos bioinformáticos . Para obter informações biologicamente relevantes a partir dos dados brutos da sequência (por exemplo, informações sobre genes existentes e seus elementos de controle), a análise da sequência de DNA segue o sequenciamento . Sem eles, qualquer informação de sequência não tem valor científico.
Sequenzierungsmethoden
Hoje existem vários métodos para ler a informação da sequência de uma molécula de DNA, mas os desenvolvimentos posteriores do método de acordo com Frederick Sanger ainda são usados principalmente. O método de Maxam e Gilbert é principalmente de interesse histórico. O pirosequenciamento mais recente, usado para aplicações especiais, oferece possibilidades de sequenciamento acelerado por meio de uso altamente paralelo.
Método Maxam e Gilbert
O método de 1977 de Allan Maxam e Walter Gilbert é baseado na clivagem química de base específica do DNA usando reagentes adequados e subsequente separação dos fragmentos por eletroforese em gel .
O DNA é primeiro marcado na extremidade 5′ com fosfato radioativo . Em quatro lotes separados, bases específicas são então modificadas e clivadas da cadeia principal de açúcar-fosfato do DNA, por exemplo, a base guanina (G) é metilada pelo reagente sulfato de dimetila e por tratamento alcalino com piperidina removido. A fita de DNA é então completamente dividida nos pontos agora livres de bases. Em cada abordagem, são formados fragmentos de diferentes comprimentos, cuja extremidade 3′ sempre foi clivada em bases específicas. A eletroforese em gel separa os fragmentos por comprimento, resolvendo as diferenças de comprimento por uma base. A sequência do DNA pode ser lida comparando os quatro lotes no gel. Este método permitiu que seus inventores determinassem a sequência de operons de um genoma bacteriano. O método raramente é usado hoje porque requer reagentes perigosos e é mais difícil de automatizar do que o método didesoxi desenvolvido por Sanger ao mesmo tempo.
O método didesoxi de Sanger
O método didesoxi segundo Sanger também é chamado de síntese de terminação de cadeia e representa um método enzimático , foi desenvolvido por Sanger por volta de 1975 e já apresentado em 1977 com o primeiro sequenciamento completo de um genoma ( bacteriófago φX174 ). Sanger dividiu o Prêmio Nobel de Química de 1980 com Gilbert por seu trabalho no sequenciamento de DNA.
A partir de uma pequena seção de sequência conhecida ( primer ), uma das duas fitas de DNA complementares é estendida pela enzima DNA polimerase . Primeiro, a dupla hélice do DNA é desnaturada por aquecimento, após o qual as fitas simples ficam disponíveis para processamento adicional. Em quatro abordagens idênticas (todas contêm os quatro nucleotídeos ), uma das quatro bases é adicionada em parte como trifosfato de didesoxinucleosídeo (ddNTP). Esta quebra de cadeia-ddNTPs não possuem um grupo 3′-hidroxi: se forem incorporados na fita recém-sintetizada, a DNA polimerase não pode mais alongar o DNA, pois o grupo OH no átomo 3′-C é responsável pela ligação ao fosfato grupo do próximo nucleotídeo ausente. Como resultado, são formados fragmentos de DNA de diferentes comprimentos, que sempre terminam com o mesmo ddNTP em cada lote. O primer ou os ddNTPs são marcados radioativamente. Após a reação de sequenciamento, os produtos de terminação rotulados de cada lote são analisados usando eletroforese em gel de poliacrilamida dividido longitudinalmente. Ao comparar as quatro abordagens, pode-se ler a sequência após o desenvolvimento do gel radioativo em um filme fotográfico. A sequência complementar correspondente é a sequência do molde de DNA de fita simples usado . Atualmente, uma variação da reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada como reação de sequenciamento . Ao contrário da PCR, apenas um primer é usado para que o DNA seja amplificado apenas linearmente.
Os trifosfatos de didesoxinucleosídeos marcados com corantes fluorescentes têm sido usados desde o início da década de 1990. Cada um dos quatro ddNTPs é acoplado a um corante diferente. Essa modificação torna possível adicionar todos os quatro ddNTPs em um recipiente de reação, eliminando a necessidade de lotes separados e o manuseio de radioisótopos. Os produtos de terminação de cadeia resultantes são separados usando eletroforese capilar e excitados para fluorescência usando um laser. Os ddNTPs no final de cada fragmento de DNA apresentam fluorescência de cores diferentes e podem ser reconhecidos por um detector. O cromatograma (a sequência de sinais de cores que aparecem no detector) reflete diretamente a sequência das bases da fita de DNA sequenciada.
Pirosequenciamento
O pirosequenciamento, como o sequenciamento de Sanger, usa a capacidade da DNA polimerase de ler o DNA. No entanto, a DNA polimerase é observada até certo ponto “em ação”, pois anexa sucessivamente nucleotídeos individuais a uma fita de DNA recém-sintetizada. A incorporação bem-sucedida de um nucleotídeo é facilitada por um sofisticado sistema enzimático envolvendo a luciferase traduzido em um flash de luz e capturado por um detector. O DNA a ser sequenciado serve como fita molde e é fita simples. Começando com um primer, a extensão da fita ocorre nucleotídeo por nucleotídeo através da adição controlada de trifosfatos de nucleosídeos (NTPs). Um sinal é obtido quando o nucleotídeo apropriado (complementar) é adicionado, mas o flash de luz não ocorre quando os NTPs são inadequados. Como o excesso de NTP é rapidamente removido da solução, não há mistura de sinal. Se vários nucleotídeos idênticos são incorporados um após o outro, o sinal obtido é proporcional ao número de nucleotídeos. Essa possibilidade de avaliação quantitativa dos sinais é um dos pontos fortes do pirosequenciamento. É usado para determinar a frequência de certas mutações genéticas (SNPs).polimorfismo de nucleotídeo único ), usado, por exemplo, no estudo de doenças hereditárias. O pirosequenciamento é fácil de automatizar e é adequado para análises altamente paralelas de amostras de DNA.
Sequenciamento por Hibridização
Para isso, seções curtas de DNA ( oligonucleotídeos ) são fixadas em um arranjo de matriz em um transportador de vidro ( chip de DNA ou microarray ). Os fragmentos de DNA a serem sequenciados são marcados com corantes e a mistura de fragmentos é aplicada à matriz oligonucleotídica de modo que seções de DNA complementares fixas e livres possam hibridizar umas com as outras. Depois de lavar os fragmentos não ligados, o padrão de hibridização pode ser lido a partir das marcações de cores e sua intensidade. Uma vez que as sequências dos oligonucleotídeos fixos e suas áreas sobrepostas são conhecidas, pode-se, em última análise, deduzir a sequência geral subjacente do DNA desconhecido a partir do padrão de cor.