Você pode usar o sequenciamento de Sanger para determinar a sequência de bases dentro de uma molécula de DNA .
O sequenciamento de DNA é a determinação da sequência de nucleotídeos em uma molécula de DNA. Até recentemente, o método mais comum de sequenciamento de DNA era o método de Sanger. Esse método também é chamado de sequenciamento de terminação de cadeia ou método didesoxi. O nome dado aqui foi o uso de blocos de construção modificados da síntese de DNA, os chamados ddNTPs ou didesoxinucleotídeos.
Eles não têm um grupo 3′-hidroxi livre. Se eles são incorporados na fita recém-sintetizada, não é mais possível para a DNA polimerase alongar o DNA. Em princípio, o sequenciamento de DNA de acordo com Sanger funciona como um PCR. Em contraste com a PCR, apenas um primer é adicionado no sequenciamento de DNA, que é estendido anexando os dNTPs até que um ddNTP seja usado como um bloco de construção em vez de um dNTP.
Como o grupo 3′-OH livre está ausente nos ddNTPs, nenhum nucleotídeo adicional pode ser adicionado, a extensão é interrompida aqui. As fitas individuais resultantes de diferentes comprimentos, cada uma terminando com um ddNTP marcado com um corante fluorescente específico, são então separadas eletroforeticamente em um sequenciador capilar (ABI3730, Thermo Fisher Scientific).
O sequenciamento de Sanger explicado simplesmente
O sequenciamento de Sanger ou síntese de terminação de cadeia é um método importante no sequenciamento de DNA . Eles permitem que você determine a sequência dos blocos de construção individuais do DNA ( nucleotídeos ) e, portanto, a sequência das bases 
(adenina, timina, guanina e citosina). Nossa informação genética está escondida neles.
O princípio básico do sequenciamento de Sanger é usar enzimas para gerar seções de DNA de diferentes comprimentos, cada uma das quais difere por apenas um par de bases. Eles podem então ser analisados de acordo com seu comprimento. Podemos então deduzir a sequência de base através do desvio.
Utilizamos métodos de sequenciamento, por exemplo, para detectar doenças hereditárias (precoce) ou para esclarecer relações familiares .Definição
O sequenciamento de Sanger (método de terminação de cadeia, método didesoxi) é usado para determinar a sequência exata dos nucleotídeos no DNA. É um método clássico de sequenciamento de DNA.
Sequenciamento de DNA Sanger
O sequenciamento de Sanger recebeu o nome de seu desenvolvedor, Frederick Sanger. É considerado um método clássico no sequenciamento de DNA e vem sendo continuamente desenvolvido e aprimorado. Ele ainda é usado em laboratórios hoje. No entanto, não é tão poderoso e muitas vezes é substituído por métodos mais modernos (“ sequenciamento de próxima geração ”).
Um pré-requisito para o sequenciamento de DNA de acordo com Sanger é que conhecemos uma pequena região de sequência da seção de DNA a ser examinada. Um iniciador ( primer ) adequado, produzido artificialmente, pode então “encaixar” na seção para que a enzima DNA polimerase usada possa iniciar seu trabalho. Isso consiste em armazenar blocos de construção de DNA adequados na fita molde e ligá-los. A funcionalidade da reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada aqui.
Se você quiser saber exatamente como funciona uma reação em cadeia da polimerase e onde mais ela é usada, não deixe de assistir ao nosso vídeo!
Processo de sequenciamento Sanger
Agora vamos dar uma olhada na sequência exata e geral do sequenciamento de acordo com Sanger.
desnaturação
Primeiro, o DNA de fita dupla cuja sequência de bases queremos descobrir é desnaturada sob a influência do calor (cerca de 90 graus). Agora temos duas fitas simples cada. Uma das duas fitas serve como modelo para o sequenciamento, com o qual continuamos agora.
Primeranlagerung (Primerhybridisierung)
Na próxima etapa – a hibridização do primer – um iniciador (primer) consistindo de alguns nucleotídeos é anexado à seção apropriada (complementar) na fita de DNA molde.
Preparação dos lotes de reação
Em seguida, preparamos 4 misturas de reação paralelas , basicamente idênticas, que consistem nos seguintes ingredientes:
- as seções de fita simples de DNA (modelo) a serem examinadas com primers anexados
- Blocos de construção de DNA (nucleotídeos) com as 4 bases de DNA
- das Enzym DNA Polymerase
Além disso, cada lote contém nucleotídeos de parada especiais (didesoxinucleotídeos). Eles têm a propriedade especial de que só podem se conectar a outro nucleotídeo de um lado. Em termos concretos, isso significa que a síntese de DNA é interrompida quando um dos blocos de construção de parada é inserido. Por esse motivo, você também se refere ao sequenciamento Sanger como um método de terminação de cadeia .
Observe: Cada lote contém apenas um tipo de nucleotídeo de parada (um com um bloco de construção de parada de adenina, o próximo com timina, outro com guanina e o último com citosina)
polimerização
Agora, a DNA polimerase pode iniciar seu trabalho e, a partir do primer, adicionar novos blocos de construção de DNA adequados e ligá-los (= polimerização ).
Isso provavelmente soa familiar para você da replicação do DNA em nossas células ou na reação em cadeia da polimerase (PCR).
A polimerização agora ocorre até que a DNA polimerase ligue um nucleotídeo de parada. Nesse caso, a síntese de DNA é interrompida. Importante: A terminação da cadeia é puramente aleatória .
Após algum tempo, os vasos de reação inferiores contêm fragmentos de DNA de diferentes comprimentos, cada um dos quais sempre termina com o mesmo nucleotídeo de parada (dependendo da abordagem, adenina, timina, guanina e citosina). A corrente sempre se rompe na mesma base, mas em um ponto diferente. O objetivo é produzir todos os fragmentos de sequência teoricamente possíveis.
avaliação
Continuamos com a avaliação de nossos fragmentos de DNA de diferentes comprimentos:
Com a ajuda da chamada eletroforese em gel , é possível separá-los de acordo com seus respectivos comprimentos, de modo que diferem apenas por um par de bases.
Ao aplicar uma voltagem elétrica, os fragmentos mais curtos e mais leves do DNA carregado negativamente migram para o pólo positivo mais rapidamente do que os fragmentos de DNA mais longos e mais pesados.
Se agora lermos os respectivos nucleotídeos de parada no gel de baixo para cima, obteremos a sequência de bases. Sua sequência complementar corresponde então ao nosso modelo de DNA desde o início.
Aliás, os blocos de batente agora são acoplados com corantes fluorescentes – claro que com uma cor diferente dependendo da base para distingui-los. Isso tem a vantagem de que precisamos apenas de um vaso de reação. Podemos então observar as cores após a excitação por um laser e assim deduzir as respectivas bases.
Mas atenção: Após cada sequenciamento, sempre deve ser feita uma análise da sequência de DNA, pois só conhecemos a sequência das bases, mas ainda não sabemos exatamente para que servem os cortes. Só então o chamado código genético é decifrado.