O que é a coloração de Gram

A coloração de Gram é um método de coloração combinado. Isso significa que pelo menos dois corantes diferentes são usados ​​neste método.

No final do século XIX, o patologista dinamarquês Hans-Christian Gram desenvolveu a coloração de Gram, que leva seu nome, para poder distinguir e diferenciar melhor os diferentes tipos de bactérias . Esta coloração ajuda a visualizar as diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Foi assim possível pela primeira vez distinguir entre dois grandes grupos taxonomicamente importantes: bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Ainda hoje, a coloração de Gram é o padrão ouro no diagnóstico bacteriológico e costuma ser uma das primeiras colorações realizadas em uma preparação. Essa coloração permite que você tome uma decisão inicial sobre quais antibióticos podem ser usados ​​contra a bactéria e quais, devido à estrutura da parede celular, serão ineficazes.

Coloração de Gram simplesmente explicada

Com a coloração de Gram (também coloração de Gram) você pode dividir as bactérias em dois grupos de acordo com a composição de sua parede celular . Aqui você colore as bactérias a serem examinadas com um corante (violeta cristal).

Dependendo se o corante se dissolve em etanol ou não, você pode diferenciar entre bactérias gram-negativas (parede celular com uma camada fina de mureína ) e gram-positivas (parede celular com uma camada espessa de mureína ).

Definição de coloração de Gram

A coloração de Gram é um método analítico desenvolvido pelo bacteriologista Hans Christian Gram. Ele pode ser usado para determinar a composição da parede celular bacteriana e, assim, distinguir entre dois grandes grupos de bactérias.

• Gram-positivos – Se uma preparação for designada como gram-positiva, tem célula bacteriana uma camada espessa de peptidoglicano de várias camadas (também chamada de camada de mureína) e, portanto, é de cor azul/púrpura . Se uma amostra ficar apenas parcialmente azul, ainda é chamada de Gram-positiva. As preparações gram-positivas aparecem azul-violeta e têm uma camada de mureína multicamadas.
• Gram-negativos – Quando uma amostra é gram-negativa, as células apresentam uma fina mureína (ou seja, uma ou algumas camadas). A preparação ficará vermelha  . As amostras Gram-negativas aparecem vermelhas e têm apenas uma fina camada de mureína.

Não só a cor da preparação corada com Gram é importante, mas também a morfologia  das bactérias individuais. Este é um critério muito bom para poder tirar conclusões sobre um grupo específico de bactérias. São bactérias em cadeia, esféricas (chamadas cocos na literatura especializada) ou em forma de clava (corineformes)? A morfologia das bactérias é diversa e ajuda a encontrar um diagnóstico.

Repetição: Estrutura da parede bacteriana

Aqui está uma breve recapitulação da estrutura básica das paredes celulares bacterianas:

Paredes gram-positivas

As paredes celulares Gram-positivas têm uma estrutura simples:

No interior, eles envolvem o citoplasma com uma membrana citoplasmática que consiste em uma camada dupla de fosfolipídios. Diretamente conectado ao exterior está um murein espesso e de várias camadas. Este peptidoglicano pode consistir em até 40 camadas.

Além de outras proteínas, os ácidos teicóicos e os ácidos lipoteicóicos são incorporados na parede celular. Eles estão ancorados em diferentes profundidades na parede celular (ácidos lipoteicóicos e se projetam mais na parede celular do que os ácidos teicóicos).

Esses dois ácidos são específicos para bactérias gram-positivas. As células de defesa do corpo têm até um receptor próprio para reconhecer esses ácidos. Isso permite que o inato resposta imune bom em combater bactérias gram-positivas.

As bactérias Gram-positivas incluem:

• Stahpylokokken
• Enterokokken
• estreptococos
• Listeria
• bacilos
• Clostridien.

Paredes celulares Gram-negativas

As paredes celulares Gram-negativas parecem um pouco mais complicadas:

Como as bactérias gram-positivas, elas envolvem o citoplasma com uma dupla camada de fosfolipídios. Isso agora é seguido pela mureína de camada única (ou muito poucas camadas).

Além disso, as bactérias gram-negativas também possuem uma membrana externa assimétrica, que consiste em grande parte de uma camada de fosfolipídios. No meio, há uma lacuna periplasmática que é preenchida por várias lipoproteínas de mureína. Essas proteínas conectam a membrana externa e a mureína.

Do lado de fora da membrana externa, na superfície da bactéria gram-negativa, existem várias estruturas de lipopolissacarídeos. Estes são específicos para bactérias gram-negativas e podem ser reconhecidos pelos receptores Toll-like.

As bactérias Gram-negativas incluem:

• Enterobactérias como Escherichia coli
• salmonela
• Klebsiellen
• Shigellen
• clamídia
• meningococos
• Cyanobakterien.

Parede celular de bactérias ácido-resistentes

As bactérias ácido-resistentes na verdade têm uma mureína de várias camadas. No entanto, em contraste com as bactérias gram-positivas, elas também têm uma camada externa de cera. Este consiste em ácidos micólicos e lipídios e garante a resistência ácida das bactérias. As cores da coloração de Gram não podem penetrar nesta camada.

A mureína e a camada externa são conectadas por um polissacarídeo (mais precisamente: arabinogalactano).

Instruções de coloração de Gram

A coloração de Gram é fácil e barata de produzir. Depois que as bactérias cultivadas são espalhadas em uma lâmina e fixadas com calor, restam essencialmente apenas quatro etapas:

1. Coloração da preparação
2. decapagem
3. Descolorir com álcool 
4. contracoloração.

Passo 1: Coloração da preparação

Primeiro, a amostra é corada com um tom azul-violeta. Entre outras coisas, a violeta genciana ou violeta cristal é frequentemente usada para isso.

Passo 2: decapagem

A amostra é então corada com solução de Lugol. Como a solução de Lugol contém iodo, forma-se um complexo iodo-corante. Devido a este complexo, o corante não é mais solúvel em água. A preparação agora só pode ser descolorida com álcool e não (acidentalmente) com água.

Passo 3: Descolorir com álcool

Agora vem o passo mais importante, porque aqui é feita uma diferenciação entre bactérias gram-positivas e gram-negativas. A preparação é descolorida com álcool (se você adicionar um pouco de acetona ao álcool, o processo é ainda mais rápido). 

• Se a parede celular tiver um peptidoglicano espesso, a cor azul-violeta permanece na bactéria (gram-positiva). 
• No entanto, se for um peptidoglicano fino, é lavado com o álcool e a preparação agora parece incolor (gram negativo) novamente.

contracolorir

Finalmente, a preparação é corada com uma cor vermelha (por exemplo, fucsina), o que significa que as bactérias gram-negativas não parecem mais incolores e podem ser melhor avaliadas ao microscópio.

Exceções da coloração de Gram

No entanto, também existem preparações que não podem ser coradas com uma coloração de Gram. Desde que a amostra tenha sido corada corretamente, não há problema. Existem também bactérias gramlábeis que continuam a parecer incolores após uma coloração gram.

Existem várias razões pelas quais essas bactérias não se coram com uma coloração de Gram normal. Os dois mais importantes são:

1. Sem parede celular

Existem algumas bactérias que não possuem parede celular. Sem uma parede celular, também não há camada de mureína que possa ser corada. A preparação permanece incolor. Um exemplo disso é o micoplasma .

2. Parede celular resistente a ácidos

Outras bactérias, por outro lado, desenvolveram uma camada externa especial, cerosa e ácido-resistente em suas paredes celulares. Mesmo assim, nenhum corante pode assentar e colorir a preparação. Ele novamente permanece incolor na coloração de Gram.

Um exemplo disso são as micobactérias , que podem causar tuberculose, entre outras coisas.

Coloração das paredes celulares bacterianas ácido-resistentes

Se as paredes celulares bacterianas ácido-resistentes forem coradas, são necessárias manchas especiais.

A coloração de Ziehl-Neelsen é usada para micobactérias . A casca externa resistente a ácidos é primeiro derretida ou dividida (dependendo do método) por calor ou enzimaticamente. Depois disso, a célula pode ser corada com uma coloração vermelha (por exemplo, vermelho fucsina) e depois contra-corada novamente com, por exemplo, uma tonalidade azul. 

Coloração de Gram – o mais importante

• A coloração de Gram diferencia bactérias gram negativas e gram positivas.
• A coloração de Gram pode ser usada para tornar visíveis as diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.
• As bactérias Gram-positivas têm uma espessa camada de peptidoglicano na parede celular.
• As bactérias Gram-negativas têm uma fina camada de peptidoglicano.
• As bactérias que não se coram com a coloração de Gram são chamadas de “Gram-lábeis”.

Processo de coloração de Gram

Antes de iniciar a coloração de Gram, você precisa de uma preparação com as bactérias a serem examinadas. Você pode criar esses chamados preparativos para o luto de diferentes maneiras. Ou você tem material original, como cotonetes ou fluidos corporais, ou já cultivou uma amostra. Estes últimos podem ser colônias bacterianas.

Então a coloração de Gram, que consiste basicamente em quatro etapas, pode começar:

1. Tingimento : Para tingir as bactérias, você precisa de um corante básico . Principalmente a cor violeta cristal/violeta genciana é usada. Você os adiciona à preparação de Gram junto com o composto orgânico fenol. Todas as bactérias irão manchar .
2. Complexação : Na próxima etapa, você coloca uma solução de iodo e iodeto de potássio (solução de Lugol) na preparação de Gram. Essa solução garante que complexos de cores maiores sejam formados e que a cor fique “presa” nas células.
3. Descoloração : Nesta etapa, você lava a preparação Gram com 96% de etanol. Você notará que algumas bactérias perdem a cor (bactérias gram negativas) e algumas bactérias mantêm sua cor (bactérias gram positivas).
4. Contracoloração : Finalmente, trate a amostra com o corante vermelho-azul fucsina ou a solução de corante vermelho safranina/safranina. Agora, todas as bactérias que desprenderam sua cor durante a descoloração (bactérias gram negativas) ficarão vermelhas.

Depois que a coloração de Gram estiver concluída, você poderá ver as bactérias Gram-positivas em roxo e as bactérias Gram-negativas em vermelho.

degrau	reagente	Cor da célula bacteriana
Grampositiv	Gram-negativo
Tingir	Cristal violeta	tolet	tolet
complexo	A solução de Lugol	tolet	tolet
descoloração	Etanol	tolet	incolor
contracolorir	Safranina/Fucsina	tolet	vermelho

Resultado da coloração de Gram

Dependendo da cor das bactérias no final (“comportamento gram”), você pode basicamente dividi-las em dois grupos, gram-positivas e gram-negativas. No entanto, também pode haver bactérias que têm sua própria construção de parede celular e coram de maneira diferente, embora sejam gram-positivas/gram-negativas. Você pode descrever essas bactérias como “ gram-lábeis ” ou “ gram -variáveis” .

A espessura da camada de mureína desempenha um papel importante aqui. A mureína é uma macromolécula composta de açúcares e aminoácidos e é encontrada nas paredes celulares das bactérias. Archaea não contém mureína.

Grampositive Bakterien

No caso de bactérias gram-positivas, a cor púrpura permanece após todo o tratamento. Eles têm uma camada de mureína mais espessa
de cerca de 20-80 nm . Pode constituir até 50% da matéria seca das bactérias.

Devido a essa camada mais espessa, o corante não pode se mover para fora da célula e, portanto, não pode se dissolver em etanol.

Exemplos de bactérias gram-positivas são as bactérias Actinobacteria e Firmicutes.

Bactérias Gram-negativas

As bactérias Gram-negativas não retêm sua coloração após o tratamento com etanol . Você pode então tingi-los de vermelho com fucsina/safranina. As bactérias Gram-negativas têm uma camada de mureína um pouco mais fina, inferior a 10 nm. Aqui, ela representa apenas cerca de 5-10% da massa seca bacteriana.

O corante pode se mover através dessa camada mais fina para o exterior da célula e é lavado pelo etanol.

As bactérias Gram-negativas são, por exemplo, cianobactérias ou proteobactérias.

Outros métodos para examinar a parede celular

Além da coloração de Gram, você também pode escolher outros métodos para examinar as características da parede celular bacteriana.

Um método é o teste KOH . Com isso você trata as bactérias com uma gota de solução de hidróxido de potássio (KOH) a 3%.

A parede celular das bactérias gram-negativas pode ser dissolvida/lisada por esta solução. As células se rompem e o DNA é liberado. Se você agora passar uma agulha pela solução, um pequeno fio de DNA se forma ao redor dela.

Para bactérias gram-positivas , a solução de KOH é muito fraca para dissolver sua parede celular. Nenhum DNA é liberado aqui e você não poderá observar qualquer formação de fio na agulha.

Outro teste utilizado para examinar a parede celular de bactérias é o teste da aminopeptidase