A hibridização de DNA é um método em engenharia genética.
A hibridização de DNA pode ser usada para identificar e detectar DNA desconhecido ou mutações usando sondas de DNA marcadas.
A hibridização do DNA simplesmente explicada
O genoma de humanos e chimpanzés difere em apenas cerca de 1,6% dos genes – pesquisadores descobriram isso usando hibridização de DNA . Mas como funciona o processo?
Em biologia, hibridização significa que duas fitas simples de DNA ou RNA se combinam para formar um ácido nucleico de fita dupla. Isso só pode ocorrer se a seqüência de bases nas duas fitas individuais corresponder tanto quanto possível – ou seja, for complementar . Aqui, as interações entre os respectivos pares de bases são formadas – as chamadas ligações de hidrogênio .
Muitos pesquisadores aproveitam o mecanismo de hibridização, por exemplo, para determinar as relações familiares e identificar certos segmentos de ácidos nucléicos em uma mistura. definição de hibridização
Em biologia molecular, hibridização (lat. hybrida = mestiço) é a formação de um ácido nucleico de fita dupla em que as duas fitas são de origens diferentes.
processo de hibridização de DNA
Agora vamos dar uma olhada passo a passo em como funciona a hibridização de DNA.
1. Desnaturação
Primeiro, o DNA de fita dupla é aquecido – a cerca de 90 graus Celsius. As altas temperaturas garantem que as ligações de hidrogênio entre as fitas duplas do DNA se rompam. Isso é o que você chama de desnaturação . Agora temos duas fitas simples de DNA de uma fita dupla de DNA.
Exemplo : O grau de relacionamento entre humanos e chimpanzés deve ser descoberto. Para isso, amostras de DNA de humanos e chimpanzés são aquecidas em recipientes separados para obter fitas simples.
2. Renaturação
A mistura agora é resfriada lentamente – cerca de 25 graus abaixo do ponto de fusão. É aqui que ocorre a renaturação . Neste processo, duas fitas simples correspondentes são ligadas uma à outra novamente. Se houver diferentes vertentes individuais, você está falando de um híbrido .
Exemplo : As fitas simples de DNA humano são agora misturadas com fitas simples de DNA de chimpanzé. Após o resfriamento, um chamado DNA híbrido é formado. É, portanto, uma ‘mistura’ que consiste em uma fita simples de DNA humano e uma fita simples de DNA de chimpanzé.Marca
A hibridização DNA / DNA é a união de duas fitas simples diferentes de DNA . Um DNA :Híbrido de DNA é formado . A hibridização
DNA / RNA é a ligação de um DNA a uma única fita de RNA . Um DNA : Híbrido de RNA é formado aqui.
Em uma análise de relacionamento, há agora um terceiro passo:
3. Aquecendo os DNAs híbridos
Para descobrir quão alto é o grau de relação, a mistura deve ser aquecida novamente. Isso permite que você descubra quantos pares de bases se formaram entre as fitas individuais.
O seguinte se aplica: Quanto mais semelhante for a sequência de bases complementares das duas fitas simples no DNA híbrido, mais energia – isto é, uma temperatura mais alta – é necessária para a separação nas respectivas fitas simples. Isso ocorre porque um melhor pareamento de bases resulta na formação de mais ligações de hidrogênio.
Então você pode dizer: quanto maior o ponto de fusão do DNA híbrido, mais próximo o grau de parentesco.
A hibridização de DNA também pode ser usada para identificar seções específicas de DNA de uma mistura. Por exemplo, os pesquisadores querem usá-lo para encontrar uma mutação genética específica . Aqui você geralmente usa as chamadas sondas de genes (também sondas de DNA). Com isso, você quer dizer cadeias de DNA de fita simples mais curtas, produzidas sinteticamente, que são complementares a uma seção de DNA que você está procurando – aqui, por exemplo, para a mutação que você está procurando.
As sondas são geralmente marcadas radioativamente ou providas de um marcador fluorescente . Desta forma, a hibridização pode ser facilmente detectada no final.
Como funciona:
- Marcação da sonda: por exemplo, com um corante fluorescente ou isótopos radioativos.
- Fixação do DNA (ou RNA): O ácido nucleico desnaturado é separado em um material de suporte, por exemplo um gel de agarose ou poliacrilamida .
- Hibridação : As sondas genéticas são adicionadas ao DNA. As sondas podem agora hibridizar com as fitas de DNA apropriadas se houver uma sequência apropriada na mistura.
- Detecção dos marcadores: As moléculas recém-formadas podem agora ser detectadas com base no marcador.
O método pode ser usado, por exemplo, para detectar doenças hereditárias, como a anemia falciforme .
A hibridização de DNA é um método de engenharia genética . O DNA é hibridizado quando duas fitas simples do DNA se ligam para formar uma fita dupla . Isso só é possível se as duas fitas individuais tiverem uma sequência de bases complementar , ou seja, as bases correspondentes estiverem na outra fita. Neste caso, os fios individuais se conectam automaticamente.
Este mecanismo é usado em muitos métodos biológicos moleculares. Por exemplo, sequências estranhas dentro do DNA podem ser identificadas dessa maneira. As chamadas sondas genéticas são usadas para este propósito. Estas são seções marcadas de DNA que são adicionadas a uma mistura de diferentes moléculas de DNA. Se essa mistura contiver uma sequência que corresponda à sonda do gene, ela se ligará à sonda do gene. A nova molécula agora pode ser identificada graças à sonda marcada.
O princípio de hibridização de DNA também é usado, por exemplo, durante a PCR . Os primers (segmentos curtos de RNA ), que marcam o início da polimerase , são hibridizados com o DNA a ser amplificado. Eles só podem hibridizar onde a sequência do primer coincide com a sequência de DNA. Assim, pode-se controlar o ponto de partida da PCR.
As enzimas de restrição também têm trechos curtos de DNA que se ligam a pedaços mais longos e marcam o ponto em que a enzima de restrição deve cortar o DNA.
Hibridização de DNA – procedimento e vantagens
O DNA é sempre formado por duas fitas complementares. A montagem de DNA complementar ou fragmentos de RNA é chamado de hibridização. Quando o DNA de fita dupla é aquecido acima de 90°C, a molécula desnatura e se decompõe em fitas simples. Quanto maior o número de pares de bases complementares existentes dentro das fitas, maior deve ser a temperatura de fusão.
O resfriamento subsequente a uma temperatura de pelo menos 25°C abaixo do ponto de fusão leva à renaturação, durante a qual os fios podem se reconectar. As fitas simples também devem ser desnaturadas para que os pares de bases individuais dentro da fita também possam se separar um do outro.
Quanto mais pares de bases entre as fitas são complementares, mais ligações de hidrogênio são formadas entre as bases nucléicas durante a renaturação, o que fortalece e estabiliza toda a fita híbrida.
As enzimas já conhecidas utilizadas para hibridização são referidas como sondas ou marcadores e são normalmente fornecidas com um corante fluorescente ou marcadas radioactivamente antes da hibridação. No laboratório, a tecnologia de gel ou filtro é geralmente usada para hibridização. Para isso, o DNA é desnaturado e separado em gel poliacrílico ou de agarose ou em filtro de nitrato de celulose.
Estes são então incubados com uma solução do DNA marcado radioativamente. O resíduo radioativo não ligado é removido usando uma desoxirribonuclease. A substância radioativa restante é usada como guia para a complementaridade das bases nas amostras. A hibridização também pode ser realizada por cromatografia em solução em hidroxiapatita. O procedimento é dividido em quatro etapas:
- Rotulagem do marcador (corante radioativo ou fluorescente)
- Fixação do DNA ou RNA
- hibridização
- Detecção dos marcadores
Hibridação de DNA/RNA
Quando o DNA é hibridizado com RNA, o RNA radioativo pode hibridizar com DNA cromossômico e os genes podem assim ser isolados ou a multiplicidade gênica determinada.
Hibridação DNA/DNA
Quando o DNA que foi previamente desnaturado é resfriado, novas fitas duplas podem se formar. Se isso acontecer com dois duplexes de DNA diferentes ao mesmo tempo, os novos duplexes serão uma mistura dos dois DNAs e conterão moléculas híbridas se antes tivessem a mesma sequência.
Essa hibridização também serve para demonstrar a multiplicidade gênica. Se compararmos as temperaturas de fusão dos híbridos individuais que se formaram, também podemos determinar a proximidade evolutiva dos vários organismos entre si.
Vantagens e benefícios da hibridização
- Pode-se pesquisar quão alta é a proporção de sequências de DNA repetidas no genoma.
- As sequências de ácidos nucleicos individuais podem ser isoladas a partir de uma mistura.
- A localização e o comprimento da região de codificação do DNA eucariótico podem ser elucidados por hibridização de mRNA.
- Com a ajuda de sondas, a ocorrência e localização de sequências específicas em diferentes cromossomos podem ser determinadas.
- Usando a chamada técnica de blotting, fragmentos de DNA separados por eletroforese em gel podem ser localizados e identificados com a ajuda de sondas.
- A técnica de hibridização também está ganhando terreno na pesquisa neurobiológica, por exemplo. B. em fatias de cérebro, em importância.
aplicação e benefícios
Aqui listamos algumas áreas de aplicação da tecnologia de hibridização:
- Repetição de sequências de DNA no genoma: mede a rapidez com que a renaturação ocorre. Desta forma, pode-se determinar quão alta é a proporção de seções de DNA repetidas no genoma . Em humanos, isso é cerca de 30 a 35 por cento.
- Relações entre diferentes organismos: Dependendo da temperatura de fusão de um DNA hibridizado, o grau de relação pode ser determinado. Com base nisso, as árvores genealógicas podem ser criadas e a evolução das respectivas espécies pode ser traçada.
- Combinação com outros métodos de engenharia molecular :
- Southern Blot : O método é usado para detectar uma sequência de DNA em uma mistura de DNA.
- Northern Blot : Você pode usar este método para detectar moléculas de RNA específicas de uma mistura de RNA.
- Hibridização in situ : Este método pode ser usado para identificar ácidos nucleicos em tecidos, células individuais ou em cromossomos .
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Os pesquisadores também fazem uso do princípio da hibridização do DNA na reação em cadeia da polimerase – PCR para abreviar. PCR é um método de amplificação de seções desejadas de DNA.
Para determinar o ponto de partida da seção, você precisa dos chamados primers . São moléculas curtas de fita simples compostas por vários nucleotídeos. A hibridização (aqui: hibridização do primer) pode ocorrer porque eles se encaixam exatamente na região inicial da seção de DNA .