reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método laboratorial para amplificar seções desejadas de DNA . 

A reação em cadeia da polimerase ou PCR é um processo dependente de enzimas para amplificar certas sequências de genes dentro de uma cadeia de DNA existente. Em condições fisiológicas, ocorre em todas as células durante a replicação e também pode ser utilizada em engenharia genética para a amplificação in vitro de sequências gênicas.

No jargão médico , PCR é frequentemente usado como sinônimo de qualquer diagnóstico baseado em testes de ácido nucleico , mesmo que não seja tecnicamente uma reação em cadeia da polimerase.

Reação em cadeia da polimerase (PCR) explicada de forma simples

Mas por que realmente precisamos de tantas seções de DNA (ácido desoxirribonucleico)? Muito simplesmente, porque muitas vezes não há material de DNA suficiente disponível para os pesquisadores continuarem trabalhando, por exemplo, na ciência forense ou na medicina. É aqui que a reação em cadeia da polimerase , ou PCR abreviada , entra em ação. 

O mecanismo da reação em cadeia da polimerase é semelhante à duplicação natural do DNA ( replicação do DNA ) em seu corpo. Uma enzima específica está envolvida em ambos os processos: DNA polimerase . Ele garante que as fitas de DNA sejam “construídas” empilhando blocos de construção de DNA ( nucleotídeos ) como tijolos de Lego e conectando-os uns aos outros.  

O termo reação em cadeia significa que os produtos de um curso de reação são usados ​​para cursos subsequentes. Cada processo de reação ( ciclo ) sempre inclui três etapas de reação (desnaturação, hibridização do primer e amplificação). Para obter a quantidade desejada de DNA, no entanto, temos que passar por pelo menos 20 desses ciclos. 

Definição de PCR

reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica enzimática usada para produzir rapidamente cópias de DNA de um segmento de DNA desejado. Etapas de PCR : desnaturação, hibridização de primers e amplificação.

Visão geral da reação em cadeia da polimerase

A reação em cadeia da polimerase é baseada no mecanismo de replicação do DNA celular . Em contraste com esta duplicação de DNA natural, apenas seções relativamente curtas podem ser copiadas aqui. 

Com a ajuda do método PCR, você pode amplificar artificialmente (in vitro) automaticamente uma seção de DNA definida com precisão. Você também pode se referir à reação em cadeia da polimerase como amplificação de DNA (lat. amplificare = “ampliar”, “aumentar”). 

Para iniciar o método PCR, precisamos dos seguintes ingredientes : 

  • um modelo de DNA de fita dupla conhecido
  • dois primers curtos produzidos artificialmente (= sequências iniciadoras que consistem em 15-30 bases de DNA), que podem corresponder (complementarmente) às extremidades do DNA a ser amplificado
  • muitos blocos de construção de DNA livres ( nucleotídeos ) com as 4 bases de DNA (adenina, timina, guanina e citosina) 
  • polimerases de DNA termoestáveis (de bactérias termofílicas ou archaea , por exemplo, Taq polimerase)
  • uma solução tampão que fornece um ambiente adequado para a DNA polimerase funcionar
  • um dispositivo que define as temperaturas necessárias para as respectivas etapas ( termociclador )

Processo de PCR

Agora vamos dar uma olhada no processo de PCR. Este é um processo cíclico no qual 3 etapas de reação são repetidas aproximadamente 20-50 vezes: desnaturação, hibridização do primer e amplificação . 

Etapa 1: desnaturação

Vamos começar com o primeiro passo – a desnaturação . Aqui, o recipiente de reação com os ingredientes descritos acima é primeiro aquecido a cerca de 90 graus Celsius no termociclador. As altas temperaturas garantem que as ligações de hidrogênio entre as fitas duplas do DNA se rompam. Isso é o que você chama de desnaturação. Agora temos duas fitas simples de DNA de uma fita dupla de DNA, que servem como molde para sua replicação. 

Ao aquecer o ensaio de teste até 96° C , o DNA é desnaturado pela divisão das ligações de hidrogênio entre as duas cadeias do DNA a serem amplificadas. O ácido nucleico é então de fita simples.

Etapa 2: hibridização do primer

Na segunda etapa – a chamada hibridização do primer – a mistura de reação deve ser resfriada a cerca de 50-65 graus (dependendo do comprimento do primer). Agora, os primers (moléculas iniciadoras) podem se ligar às respectivas fitas modelo (= primer annealing ).

O princípio do pareamento de bases complementares (adenina com timina e guanina com citosina) se aplica aqui: os primers se encaixam exatamente nas extremidades (3′) dos moldes de fita simples. Como adicionamos dois primers diferentes, podemos determinar com precisão o início e o fim da sequência desejada. 

Durante o hibridização ou hibridização do primer, a mistura de teste é resfriada a cerca de 55 a 65°C e os primers ligam-se cada um à extremidade 3′ da sequência do gene. A temperatura específica depende da sequência de ácido nucleico e do comprimento dos primers usados.

Etapa 3: amplificação

Na terceira etapa da reação – chamada de amplificação, alongamento ou polimerização – a temperatura é aumentada novamente. Isso é necessário para atingir a temperatura ideal de trabalho da enzima DNA polimerase (cerca de 70 graus Celsius). Ele precisa dos primers de PCR inseridos anteriormente como iniciador para iniciar seu trabalho. 

Isso consiste em anexar e ligar os blocos de construção de nucleotídeos adicionados apropriados à extremidade 3′ do primer. Desta forma obtemos uma sequência de DNA que é complementar à fita molde. 

No final da fase de alongamento, podemos agora começar novamente com a etapa 1 – desnaturação – para separar as duas fitas duplas contidas e permitir a reprodução renovada. 

Um ciclo leva apenas alguns minutos para obter duas cópias idênticas do DNA alvo. Agora, se repetirmos esse ciclo muitas vezes, o número de cópias também aumentará exponencialmente (1-2-4-8-16 etc.). 

Durante o alongamento , a polimerase sintetiza a fita complementar a uma temperatura de aproximadamente 72°C do primer na direção 5′-3′. A primeira passagem cria cadeias de comprimento variável porque a polimerase para de sintetizar após replicar um número aleatório de pares de bases.

Identificação dos produtos de PCR

Ao final de todos os ciclos de PCR, os fragmentos de DNA resultantes são geralmente separados e identificados com base em seu comprimento. Porque o objetivo da PCR, como você já sabe, é amplificar uma sequência de DNA muito específica. Na prática de laboratório, no entanto, diferentes fragmentos de diferentes comprimentos são formados, razão pela qual a separação é necessária. 

Os pesquisadores costumam usar o que é conhecido como eletroforese em gel de agarose para esse fim . Com isso, você pode entender que as seções de DNA são colocadas em um gel de agarose ( açúcar ) e separadas usando voltagem elétrica. As seções mais curtas “vagueiam” mais rápido para o pólo positivo do que as mais longas.

As aplicações da PCR são diversas: É utilizada em medicina forense para relatórios de parentesco ou para análise de material genético obtido na cena de um crime ( impressão digital genética ), bem como para o diagnóstico de doenças hereditárias a partir de amostras de sangue ou biópsia de vilo corial material.

De uma forma modificada, por exemplo como PCR em tempo real , a quantidade de material genético na amostra pode ser quantificada.

O DNA necessário para a engenharia genética de proteínas é agora produzido por PCR.

Além disso, bactérias ou fungos podem ser caracterizados por meio de reações de PCR, dependendo de seu material genético. As cepas de vírus de RNA podem ser detectadas usando um método modificado, a reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa .

Variante PCR

O método de PCR original foi continuamente desenvolvido, resultando em inúmeras variantes (multiplex PCR, qPCR, RT-PCR, nested PCR …). Gostaríamos de explicar brevemente três coisas importantes para você aqui: 

qPCR (reação em cadeia da polimerase quantitativa)

Você pode usar a chamada PCR quantitativa em tempo real ou PCR em tempo real se quiser descobrir quantas seções de DNA foram produzidas (=quantificação). Isso funciona adicionando corantes fluorescentes. A quantidade de DNA pode então ser determinada em cada ciclo medindo a fluorescência em “tempo real” e não apenas no final de todos os ciclos via eletroforese em gel.

Rt-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase Transcriptase Reversa)

RT-PCR (PCR transcriptase reversa) é usado para detectar RNA (ácido ribonucleico) usando a enzima transcriptase reversa. É capaz de produzir um cDNA ( DNA complementar ) a partir de uma seção de RNA , que pode então ser multiplicado usando uma reação em cadeia da polimerase. O “desvio” é necessário porque as DNA polimerases não podem replicar o RNA. 

O método é usado, por exemplo, para determinar a informação genética (= genoma ) de vírus de RNA, que é de grande importância no diagnóstico médico. 

PCR aninhado 

Na nested PCR , duas reações de PCR ocorrem uma após a outra, com o produto de PCR desejado de uma primeira mistura de reação servindo como molde para uma segunda reação com outros primers. 

É útil quando apenas uma pequena quantidade da amostra de DNA desejada está disponível em comparação com a quantidade total da amostra. Este é o caso, por exemplo, na perícia se houver pequenas quantidades de vestígios utilizáveis ​​(por exemplo, sangue, cabelo) para condenar o perpetrador.

aplicativo PCR

O método PCR é usado em inúmeras áreas de pesquisa e ciência. 

Você já conhece uma área: a criminalística . Lá serve como uma ferramenta auxiliar para produzir material de DNA suficiente para a criação de uma impressão digital genética.  

Na medicina , também, certas infecções virais (por exemplo, HIV, Sars-COV-2) podem ser detectadas usando PCR (= teste PCR) amplificando o RNA ou DNA viral.  

Além disso, muitos métodos de sequenciamento de DNA – ou seja, determinar a sequência de bases no DNA – são baseados na reação em cadeia da polimerase. Desta forma, por exemplo, doenças hereditárias podem ser detectadas. 

Além disso, a reação em cadeia da polimerase está ajudando a paleontologia a gerar mais material de DNA a partir de criaturas fósseis encontradas. Isso pode então ser usado para obter mais conhecimento científico importante. 

Outra área relevante de aplicação da PCR é na clonagem de um gene  (= seção que codifica uma proteína). Aqui um gene é retirado de um organismo e inserido em outro. A reação em cadeia da polimerase é responsável pela multiplicação desse gene. Por exemplo, a clonagem pode levar à produção de proteínas importantes, como drogas (por exemplo, insulina humana). 

resumo

  • PCR (reação em cadeia da polimerase) é um método de genética molecular para amplificar artificialmente as seções de DNA desejadas.
  • O mecanismo é semelhante à duplicação natural do DNA ( replicação do DNA ) em nossas células.
  • Os ingredientes são o molde de DNA , dois primers, vários nucleotídeos de DNA, solução tampão e a enzima DNA polimerase
  • É uma sequência cíclica de três etapas de reação (desnaturação, hibridização do primer, amplificação)